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Hematopatologia – Linfoma não Hodgkin – (5ª edição – 2019)

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  2. Hematopatologia – Linfoma não Hodgkin – (5ª edição – 2019)
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Andréa Rodrigues Cordovil Pires, Marco Antonio Dias Filho, Antonio Corrêa Alves

Códigos de topografia

Códigos CID-O (ver listagem de diagnósticos, item VI)

I. Identificação e resumo clínico

1.1 Amostra

  • Linfonodo – especificar sítio: ________________
  • Baço
  • Pele
  • Amígdala
  • Timo
  • Medula óssea
  • Trato gastrintestinal – especificar: __________________
  • Outro órgão – especificar: __________________
  • Não especificada

 II. Dados clínicos relevantes

2.1 Linfadenopatia / lesão

  • Única
  • Localizada
  • Disseminada
  • Massa tumoral
  • Especificar local ________________________

2.2 Comprometimento mediastinal

  • Sim
  • Não
  • Tamanho aproximado ____ cm

2.3 Hepatomegalia

  • Sim
  • Não
  • Tamanho ____ cm

2.4 Esplenomegalia

  • Sim
  • Não
  • Tamanho _____ cm

2.5 Hemograma

  • Hemoglobina: _____ g/L
  • Leucócitos: _____ mm³
  • Linfócitos: _____ mm³
  • Plaquetas: _____ mm³
  • Outros dados: _________________________

2.6 Sintomas constitucionais

  • Não
  • Febre (> 38°C)
  • Sudorese noturna
  • Perda de peso (> 10% do peso nos últimos 6 meses)
  • Outros – especificar: ______________________

2.7 Antecedentes possivelmente relacionados à patogênese de linfomas

  • Infecção pelo HIV
  • Infecção pelo HTLV-1
  • Infecção pelo EBV
  • Infecção pelo Helicobacter pylori
  • Infecção pelo HHV8
  • Infecção por hepatite C
  • Doença imune – especificar: __________________
  • Outros – especificar: ________________________
  • Tempo de duração da doença: ________________

2.8 Quando em análise de possível recorrência

  • Diagnóstico prévio: _______________________________
  • Estádio no diagnóstico (ver Comentários X.1): _________
  • Tempo de doença: ______ meses
  • Tempo livre de doença: ______ meses

2.9 Terapia utilizada

  • Radioterapia (quantificar): _________________________
  • Quimioterapia (especificar): ________________________
  • Imunoterapia (especificar): ________________________
  • Transplante (especificar): ________________________
  • Outra (especificar): ________________________

 III. Procedimento cirúrgico

3.1 Procedimento

  • Biópsia por agulha grossa
  • Biópsia incisional
  • Excisional, linfonodo único
  • Excisional, linfonodos coalescentes
  • Punção aspirativa por agulha fina
  • Outro – especificar: __________________

3.2 Natureza da amostra

  • Biópsia diagnóstica
  • Análise de possível recorrência

IV.  Exame macroscópico

4.1 Tamanho da amostra:  ___ x ___ x ___ cm

4.2 Enviado

  • Intacto
  • Não intacto / seccionado
  • A fresco
  • Fixador: _____________

4.3 Superfície externa

  • Regular / bem delimitada
  • Encapsulada
  • Irregular

4.4 Coloração

  • Homogênea – descrever ________________________
  • Heterogênea – descrever ________________________

4.5 Consistência

  • Amolecida
  • Elástica
  • Firme
  • Pétrea

4.6 Superfície de corte

  • Difusa
  • Nodular
  • Trabeculada
  • Necrótica
  • Hemorrágica
  • Outra (especificar) ________________________

4.7 Fixação no laboratório

  • Formalina a 10% tamponada
  • Outra (especificar) _______________________

4.8 Material congelado

  • Sim
  • Não

4.9 Preparado citológico (“imprint” ou raspado)

  • Sim
  • Não

4.10 Documentação fotográfica

  • Sim
  • Não

4.11 Estudos especiais

  • Microbiológico
  • Microscopia eletrônica
  • Imuno-histoquímica
  • FISH – sonda: _____________________
  • Imunofenotipagem por citometria de fluxo
  • Hibridização in situ para EBER-EBV
  • PCR
  • RT-PCR
  • Sequenciamento
  • Espectometria de massa
  • Principais resultados: ________________________

V. Exame microscópico

5.1 Cápsula

  • Normal
  • Espessada
  • Espessada com septos
  • Infiltrada, com extensão extranodal

5.2 Padrão arquitetural

  • Mantido
  • Parcialmente alterado
  • Totalmente alterado

5.3 Arranjo da proliferação

  • Difusa
  • Nodular, com pequenos nódulos
  • Nodular, com nódulos grandes
  • Nodular e difusa
  • Esboçando nodularidade
  • Pseudofolicular
  • Parafolicular / interfolicular
  • Em padrão da zona do manto
  • Em padrão da zona marginal
  • Em padrão de “céu estrelado”
  • Imprecisa

5.4 Fibrose

  • Ausente
  • Traves finas e incompletas
  • Traves completas delimitando nódulos
  • Traves irregulares
  • Fibrose intersticial

5.5 Vascularização

  • Pouco evidente / preservada
  • Proliferação vascular exuberante

5.6 Necrose

  • Ausente
  • Pequeno(s) foco(s)
  • Áreas extensas

5.7 Fundo celular (R = raros; P = pequena quantidade; M = moderada quantidade; N = numerosos)

  • Linfócitos pequenos: ___
  • Células linfoides grandes: ___
  • Células linfoides médias: ___
  • Células clivadas: ___
  • Células cerebriformes: ___
  • Plasmócitos: ___
  • Histiócitos: ___
  • Neutrófilos: ___
  • Eosinófilos: ___
  • Granulomas: ___
  • Células bizarras: ___
  • Células estromais: ___
  • Inclusões nucleares positivas ao PAS com diástase: ___

5.8 Figuras de mitoses

  • Raras
  • Número moderado
  • Frequentes

5.9 Distribuição das células neoplásicas

  • Sinusal
  • Cortical
  • Interfolicular
  • Difusa
  • Irregular

5.10 Outros achados relevantes

  • Calcificação
  • Necrose
  • Granulomas
  • Padrão do retículo: ______________________
  • Outros: _______________________________
  • Diagnóstico final

Os linfomas não Hodgkin (LNH) são classificados segundo a OMS 2017 (assinaladas em itálico as formas provisórias e entre colchetes os códigos CID-O).

6.1 Neoplasias de células linfoides precursoras

  • Leucemia / linfoma linfoblástico B (LLL-B)
  • Leucemia / linfoma linfoblástico B, SOE [9811/3]
  • Leucemia / linfoma linfoblástico B, com anormalidades genéticas recorrentes – Leucemia / linfoma linfoblástico B com t(9;22)(q34.1;q11.2); BCR-ABL1 [9812/3]
  • Leucemia / linfoma linfoblástico B, com anormalidades genéticas recorrentes – Leucemia / linfoma linfoblástico B com t(v;11q23.3); KMT2A rearranjado [9813/3]
  • Leucemia / linfoma linfoblástico B, com anormalidades genéticas recorrentes – Leucemia / linfoma linfoblástico B com t(12;21)(p13.2;q22.1); ETV6-RUNX1 [9814/3]
  • Leucemia / linfoma linfoblástico B, com anormalidades genéticas recorrentes – Leucemia / linfoma linfoblástico B com hiperdiploidia [9815/3]
  • Leucemia / linfoma linfoblástico B, com anormalidades genéticas recorrentes – Leucemia / linfoma linfoblástico B com hipodiploidia [9816/3]
  • Leucemia / linfoma linfoblástico B, com anormalidades genéticas recorrentes – Leucemia / linfoma linfoblástico B com t(5;14)(q31.1;q32.1);IGH/IL3 [9817/3]
  • Leucemia / linfoma linfoblástico B, com anormalidades genéticas recorrentes – Leucemia / linfoma linfoblástico B com t(1;19)(q23;p13.3); TCF3-PBX1 [9818/3]
  • Leucemia / linfoma linfoblástico B, com anormalidades genéticas recorrentes – Leucemia / linfoma linfoblástico B, BCR-ABL1- símile [9819/3]
  • Leucemia / linfoma linfoblástico B, com anormalidades genéticas recorrentes – Leucemia / linfoma linfoblástico B com iAMP21 [9811/3]
  • Leucemia / linfoma linfoblástico T (LLA-T) [9837/3]
  • Leucemia linfoblástica de células T precursoras iniciais (ETP-ALL) [9837/3]
  • Leucemia / linfoma linfoblástico NK (entidade provisória)

6.2 Neoplasias de células linfoides B maduras

  • Leucemia linfoide crônica / linfoma linfocítico (LLC / LL) [9823/3]
    • Linfocitose de células B monoclonal, tipo linfoma linfocítico [9823/1]
    • Linfocitose de células B monoclonal, não tipo linfoma linfocítico [9591/1]
  • Leucemia pró-linfocítica B (LP-B) [9833/3]
  • Linfoma B da zona marginal esplênica (LZME) [9689/3]
  • Tricoleucemia (TRL) [9940/3]
  • Linfoma / leucemia esplênica de células B, inclassificável [9591/3]
    • Linfoma esplênico difuso de polpa vermelha, com linfócitos B pequenos [9591/3]
    • Tricoleucemia-variante (TRL-V) [9591/3]
  • Linfoma linfoplasmocítico (LLPL) [9671/3]
    • Macroglobulinemia de Waldeström (MW) [9761/3]
  • Gamopatia monoclonal IgM de significado indeterminado [9761/1]
  • Doenças da cadeia pesada (DCP) [9762/3]
    • Doença da cadeia pesada alfa [9762/3]
    • Doença da cadeia pesada gama [9762/3]
    • Doença da cadeia pesada Mu [9762/3]
  • Neoplasias de plasmócitos
    • Gamopatia monoclonal não IgM de significado indeterminado (MGUS) [9765/1]
    • Mieloma múltiplo (MM) [9732/3]
    • Plasmocitoma solitário do osso [9731/3]
    • Plasmocitoma extraósseo [9734/3]
    • Doença de depósito de imunoglobulina monoclonal – amiloidose primária [9769/1]
    • Doenças de depósito de cadeias leve e pesada da imunoglobulina [9769/1]
  • Linfoma da zona marginal extranodal do tecido linfoide associado à mucosa (linfoma MALT) [9699/3]
  • Linfoma da zona marginal nodal (LZMN) [9699/3]
    • Linfoma da zona marginal nodal pediátrico (LZMN-P) [9699/3]
  • Linfoma folicular (LF) [9690/3]
    • Grau 1 [9695/3]
    • Grau 2 [9691/3]
    • Grau 3A [9698/3]
    • Grau 3B [9698/3]
    • Neoplasia folicular “in situ” [9695/1]
    • Linfoma folicular tipo duodenal [9695/3]
  • Linfoma folicular tipo pediátrico (LF-P) [9690/3]
  • Linfoma de grandes células B com rearranjo IRF4 [9698/3]
  • Linfoma centrofolicular primário da pele (LF-Pele) [9597/3]
  • Linfoma de células do manto (LCM) [9673/3]
    • Neoplasia de células do manto “in situ” [9673/1]
  • Linfoma difuso de grandes células B, SOE (LDGCB, SOE) [9680/3]
    • Subtipo de células B do centro germinativo [9680/3]
    • Subtipo de células B ativadas [9680/3]
  • Linfoma de grandes células B, rico em células T e em histiócitos (LGCB-RTH) [9688/3]
  • Linfoma difuso de grandes células B do sistema nervoso central (LDGCB-SNC) [9680/3]
  • Linfoma difuso de grandes células B primário cutâneo, tipo “da perna” (LDGCB-perna) [9680/3]
  • Linfoma difuso de grandes células B EBV-positivo, SOE (LDGCB-EBV+) [9680/3]
  • Úlcera mucocutânea EBV-positiva [9680/1]
  • Linfoma difuso de grandes células B associado à inflamação crônica (LD-GCB-IC) [9680/3]
  • Granulomatose linfomatoide (GL) [9766/1]
    • Grau 1 ou 2 [9766/1]
    • Grau 3 [9766/3]
  • Linfoma de grandes células B primário do mediastino (tímico) (LGCB-Med) [9679/3]
  • Linfoma de grandes células B intravascular (LGCB-IV) [9712/3]
  • Linfoma de grandes células B ALK-positivo (LGCB-ALK+) [9737/3]
  • Linfoma plasmablástico (LPb) [9735/3]
  • Linfoma primário de efusões (LPE) [9678/3]
  • Doenças linfoproliferativas associadas ao HHV8
    • Linfoma de grandes células B HHV8-positivo (LGCB-HHV8+) [9738/3]
    • Doença linfoproliferativa germinotrópica HHV8-positiva [9738/1]
  • Linfoma de Burkitt (LB) [9687/3]
  • Linfoma de Burkitt com aberração 11q (LB-11q) [9687/3]
  • Linfomas de células B de alto grau
    • Linfoma de células B de alto grau com rearranjos MYC e BCL2 e/ou BCL6 (LNH “double-hit” ou “triple-hit”) [9680/3]
    • Linfoma de células B de alto grau, SOE [9680/3]
  • Linfoma de células B inclassificável, com características intermediárias entre o LDGCB e o linfoma de Hodgkin (LBI-LDGCB/LH) [9596/3]

6.3 Neoplasias de células T e NK maduras

  • Leucemia pró-linfocítica de células T (LPL-T) [9834/3]
  • Leucemia linfocítica de células T granulares grandes (LLTGG) [9831/3]
  • Doença linfoproliferativa crônica de células NK (DLPC-NK) [9831/3]
  • Leucemia agressiva de células NK (LA-NK) [9948/3]
  • Linfoma sistêmico de células T EBV+ pediátrica (DLPST-EBV+I) [9724/3]
  • Doença linfoproliferativa hydroa vacciniforme-símile (LHV) [9725/3]
  • Leucemia / linfoma de células T do adulto (LLTA) [9827/3]
  • Linfoma de células NK / T, tipo nasal (LNK/T-nasal) [9719/3]
  • Linfoma de células T intestinal
    • Linfoma de células T associado à enteropatia (LT-E) [9717/3]
    • Linfoma de células T intestinal epiteliotrópico monomórfico (LT-EM) [9717/3]
    • Linfoma de células T intestinal, SOE (LT-I) [9717/3]
    • Doença linfoproliferativa indolente de células T do trato gastrintestinal (DLIT-TGI) [9702/1]
  • Linfoma de células T hepatoesplênico (LT-HE) [9716/3]
  • Linfoma de células T subcutâneo paniculite-símile (LT-SPS) [9708/3]
  • Micose fungoide (MF) [9700/3]
  • Síndrome de Sézary (SS) [9701/3]
  • Doenças linfoproliferativas de células T CD30 positivas primárias da pele
    • Papulose linfomatoide (PL) [9718/1]
    • Linfoma de grandes células anaplásico primário da pele (LGCA-pele) [9718/3]
  • Linfoma de células T gama-delta primário da pele (LTGD-pele) [9726/3]
  • Linfoma agressivo de células T citotóxicas CD8 positivas, epidermotrópico primário da pele [9709/3]
  • Linfoma de células CD8 positivas primário cutâneo acral [9709/3]
  • Linfoma de células T pequenas / médias CD4 positivas, primário da pele [9709/3]
  • Linfoma de células T periféricas, SOE (LTP, SOE) [9702/3]
  • Linfoma de células T angioimunoblástico (LTAI) [9705/3]
  • Linfoma de células T foliculares [9702/3]
  • Linfoma de células T periféricas nodal com fenótipo T-auxiliar folicular [9702/3]
  • Linfoma de grandes células anaplásico, ALK positivo (LGCA-ALK+) [9714/3]
  • Linfoma de grandes células anaplásico, ALK negativo (LGCA-ALK-) [9715/3]
  • Linfoma de grandes células anaplásico associado a implante mamário [9715/3]

6.4 Neoplasias de células dendríticas e histiocitárias

  • Sarcoma histiocítico [9755/3]
  • Histiocitose de células de Langerhans, SOE [9751/1]
  • Histiocitose de células de Langerhans, monostótica [9751/1]
  • Sarcoma de células de Langerhans [9756/3]
  • Tumor de células dendríticas indeterminado [9757/3]
  • Sarcoma de células dendríticas interdigitantes [9757/3]
  • Sarcoma de células dendríticas foliculares [9758/3]
  • Tumor de células reticulares fibroblásticas [9759/3]
  • Doença de Erdheim-Chester [9749/3]

6.5 Doenças linfoproliferativas associadas a imunodeficiência

  • Doença linfoproliferativa pós-transplante polimórfica [9971/1]
  • Doença linfoproliferativa pós-transplante monomórfica de células B
  • Doença linfoproliferativa pós-transplante monomórfica de células T/NK

 6.6 Exemplo de laudo anatomopatológico

 Informes clínicos: linfadenopatia generalizada e esplenomegalia.

 Material: linfonodo cervical.

 Macroscopia: recebido em formalina tamponada 10%, espécime cirúrgico constituído por um linfonodo de 1,5 x 1,2 x 1,0 cm, com superfície externa ora lisa e encapsulada, ora irregular, com consistência elástica; a superfície de corte é pardacenta e homogênea. Todo o material incluído em dois blocos. Mapa de clivagem: B1-1F, B2-2F.

Microscopia: cortes histológicos de linfonodo mostrando arquitetura geral completamente desorganizada pela proliferação ora difusa, ora vagamente nodular constituída por pequenos linfócitos clivados de contornos arredondados, com citoplasma escasso, cromatina densa e sem nucléolos visíveis. Presença de histiócitos epitelioides e células foliculares dendríticas dispersas, além de hialinização focal nas vênulas de endotélio alto. Os achados sugerem linfoma não Hodgkin de pequenas células, sendo indicado o estudo imuno-histoquímico para definição.

Imuno-histoquímica:

  • CD20: positivo difusamente na membrana das células neoplásicas.
    • CD3: revela linfócitos T reacionais dispersos.
    • CD5: presença de coexpressão anômala nas células B neoplásicas.
    • Ciclina D1: positividade intensa nuclear nas células neoplásicas.
    • CD23: negativo nas células neoplásicas.
    • CD10: negativo nas células neoplásicas.
    • BCL-6: negativo nas células neoplásicas.
    • Ki-67: índice proliferativo de 35% nas células neoplásicas.

Diagnóstico: linfoma de células do manto clássico (OMS, 2017) com índice proliferativo de 35%.

 VII. Comentários

Os linfomas não Hodgkin devem ser diagnosticados de acordo com a classificação da OMS 2017, incorporando os resultados imuno-histoquímicos e de patologia molecular ao laudo histopatológico. No entanto, em casos de urgências diagnósticas, como leucemias / linfomas linfoblásticos e linfoma de Burkitt, onde qualquer atraso pode ser prejudicial ao paciente, deve-se redigir um laudo provisório com indicação de que exames adicionais estão em andamento. Caso o laboratório não realize exames imuno-histoquímico e/ou de patologia molecular, deve ser indicada a necessidade de avaliação imuno-histoquímica e/ou molecular para complementação diagnóstica.

7.1 Classificação da OMS 2017 para os linfomas não Hodgkin

A 4ª edição revisada da classificação dos linfomas da OMS 2017 é a continuidade da atualização das classificações de Kiel (1969), REAL (1994) e OMS (2001 e 2008). Esta nova revisão incorpora informações de achados clínicos, morfologia, imunofenotipagem e patologia molecular / genética para refinar as entidades já reconhecidas e descrever entidades novas e provisórias. Mantém sua importância por alcançar alta reprodutibilidade diagnóstica entre os patologistas (> 85%) com grande relevância clínica. Alguns pontos gerais e novidades dessa última classificação merecem destaque:

  • Reconhecimento de lesões iniciais: neoplasia folicular “in situ” no linfoma folicular, neoplasia de células do manto “in situ” no linfoma de células do manto, linfocitose B monoclonal na leucemia linfoide crônica / linfoma linfocítico e gamopatia monoclonal de significado indeterminado IgM e não IgM relacionadas ao linfoma linfoplasmocítico e ao mieloma múltiplo, respectivamente.
  • Fim do subtipo “Linfoma de células B inclassificável, com características intermediárias entre o linfoma de grandes células B difuso e o linfoma de Burkitt”, que foi substituído pelo grupo “Linfoma de células B de alto grau”, que engloba 2 entidades: o “linfoma de células B de alto grau, SOE” e o “linfoma de células B de alto grau com rearranjos MYC e BCL2 e/ou BCL6” (também conhecidos como linfomas tipo “double-hit” ou “triple-hit”). Importante ressaltar que para realizar este último diagnóstico é necessária realização de exame de patologia molecular, como o FISH, para confirmação das mutações genéticas. A pesquisa por imuno-histoquímica da superexpressão das proteínas MYC, BCL2 e BCL6, produzidas por esses genes não é suficiente para definir este subtipo, pois apesar da maioria dos linfomas de células B de alto grau tipo “double-hit” (definidos por exames de patologia molecular) serem também “duplo-expressores” (definidos por imuno-histoquímica), o inverso não é verdade – a maior parte dos linfomas “duplo-expressores” definidos por imuno-histoquímica não apresenta as translocações associadas nas análises moleculares. A OMS recomenda que estas análises sejam realizadas em todos os linfomas de grandes células B difusos, preferencialmente por métodos de patologia molecular, como o FISH, mas também reconhece a possibilidade de utilizar a imuno-histoquímica como ferramenta de pré-seleção.
  • Reconhecimento de variantes do linfoma folicular: linfoma folicular tipo duodenal, linfoma folicular testicular, linfoma folicular tipo pediátrico e linfoma folicular variante difusa, sendo os 3 primeiros caracterizados por curso indolente e excelente sobrevida global e os 3 últimos por frequente imuno-negatividade para BCL2.
  • Manutenção da graduação do linfoma folicular: os linfomas foliculares são classificados em grau 1 e 2 de baixo grau (grau 1: 0 a 5 centroblastos por CGA 40x; grau 2: 6 a 15 centroblastos por CGA 40x) e grau 3 (mais do que 15 centroblastos por CGA 40x; 3A – centrócitos presentes; e 3B – grupos sólidos de centroblastos) e nos padrões folicular (> 75% de padrão folicular), folicular e difuso (25 a 75% de padrão folicular), focalmente folicular (< 25%) e difuso (0%). Áreas difusas contendo mais de 15 centroblastos por CGA 40x são diagnosticadas como linfoma difuso de grandes células B com linfoma folicular grau 1, 2, 3A ou 3B associado.
  • Recomendação de subclassificação do linfoma de grandes células B difuso em “subtipos moleculares” por exame imuno-histoquímico, como alternativa aceitável à técnicas de expressão gênica: tipo “células B do centro germinativo” (CGB, melhor prognóstico) e tipo “células B ativadas” (CBA, pior prognóstico). Uma grande variedade de algoritmos imuno-histoquímicos foi proposta para essa subclassificação, mas com resultados pouco reprodutíveis. O comitê da OMS recomenda a subclassificação na prática diagnóstica diária, já que há estratégias terapêuticas para o tratamento diferenciado e específico para os LDGC-CGB e os LDGC-CBA e detalha o algoritmo de Hans, enfatizando que outros esquemas podem ser utilizados e que o algoritmo utilizado deve ser especificado no laudo.
  • Nova entidade: linfoma de grandes células B com rearranjo IRF4/MUM1, caracterizado por ocorrer em crianças e adultos jovens, na região da cabeça e pescoço, com bom prognóstico. Exibe na IHQ: MUM1+, BCL6+, CD10+ em 2/3 dos casos e BCL2+ em 2/3 dos casos. O rearranjo do gene IRF4/MUM1 pode ser confirmado por FISH, que ocasionalmente detecta também rearranjo do gene BCL6, mas não dos genes BCL2 e CD10.
  • Criação do grupo “Doenças linfoproliferatvas associadas ao HHV8”, englobando o linfoma de grandes células B HHV8-positivo e a doença linfoproliferativa germinotrópica HHV8-positiva. A Doença de Castleman multicêntrica, apesar de não neoplásica, foi incluída para auxiliar o entendimento da fisiopatologia.
  • Melhor entendimento e expansão do grupo dos linfomas anaplásicos de grandes células, com reconhecimento de novas translocações, além do gene ALK, associadas a prognóstico – DUSP22 ou IRF4/MUM1 (presentes em 30% dos casos ALK-negativos, conferindo melhor prognóstico) e TP63 (presente em 8% dos casos ALK-negativos, conferindo pior prognóstico). Adição de nova entidade: linfoma de grandes células anaplásico associado a implante mamário.
  • Melhor entendimento e expansão do grupo dos linfomas de células T periféricos, com adição de 2 novas entidades: o linfoma de células T foliculares e o linfoma de células T periféricas nodal com fenótipo T-auxiliar folicular.
  • Criação do grupo “Linfoma de células T intestinal”, para reunir as entidades relacionadas: linfoma de células T associado à enteropatia, linfoma de células T intestinal epiteliotrópico monomórfico, linfoma de células T intestinal, SOE e doença linfoproliferativa indolente de células T do trato gastrintestinal.

O diagnóstico de LNH deve ser único e enquadrado em uma das entidades da lista da OMS 2017. Se o laboratório não possuir condições técnicas para essa precisão, o patologista deverá passar para o clínico / cirurgião algum resultado parcial, por exemplo, linfoma B ou T, linfoma de células pequenas ou grandes, linfoma com baixo ou alto índice proliferativo. Com esses dados, o médico assistente poderá avaliar melhor o paciente enquanto aguarda o laudo definitivo. O diagnóstico definitivo de linfoma de baixo ou alto grau deve ser sempre evitado. Desde 1994, com a classificação REAL e depois com as classificações da OMS (2001 e 2008), houve uma mudança de paradigma quando foram reconhecidas entidades que possuem substrato clínico, morfológico, imunológico e genético.

7.3 Patologia molecular

A patologia molecular é um “ponto de não retorno” na evolução da Patologia.

Por mais de dois séculos a Patologia foi baseada em morfologia celular, arquitetura tecidual e correlação clínico-patológica.

Há cerca de meio século foi desenvolvida a primeira técnica de patologia molecular: a imuno-histoquímica, identificando antígenos proteicos (moléculas) através de anticorpos específicos com visualização por sistemas enzimáticos cromogênicos em microscópio convencional. Isso causou uma revolução: novas classificações e diagnósticos mais precisos com relevância terapêutica evidenciaram o papel-chave do Patologista no tratamento oncológico.

A evolução natural foi a imersão em níveis cada vez mais profundos: a exploração do DNA e o RNA, utilizando técnicas mais recentes, como hibridização “in situ” fluorescente (FISH) e cromogênica (CISH), reação em cadeia da polimerase (PCR), perfil de expressão gênica (GEP), sequenciamento gênico e outras técnicas genéticas, que comentaremos brevemente a seguir, com referências bibliográficas selecionadas para auxiliar a iniciar o estudo e desmistificar o assunto.

Numerosas anormalidades moleculares já foram e continuam sendo descritas em linfomas. Muitas se mostraram importantes para explicar os mecanismos moleculares subjacentes envolvidos nos linfomas e acabaram sendo incorporadas como mutações diagnósticas, preditivas e/ou prognósticas.

De forma geral, quatro tipos de anormalidades moleculares estão envolvidas na oncogênese dos linfomas e demais neoplasias: mutações pontuais, translocações, amplificações e deleções de genes. Várias técnicas estão disponíveis para detectar essas anomalias moleculares, cada uma com sua especificidade e aplicação, que devem ser conhecidas pelos Patologistas: PCR, análise citogenética convencional, FISH, CISH, arranjo CGH ou perfil de expressão gênica usando microarrays de DNA.

Para uma consulta mais detalhada da utilização da Patologia Molecular nos linfomas recomendamos a leitura do capítulo 6 da referência bibliográfica 12 (vide abaixo).

7.3.1 Imuno-histoquímica (IHQ)

Os estudos imuno-histoquímicos são particularmente úteis na distinção entre condições reativas e linfomas, distinção entre linfomas e outras neoplasias, classificação dos linfomas, determinação de prognóstico, estadiamento dos linfomas e determinação de alvos moleculares para terapia-alvo personalizada (ex. CD20, CD30, BCL2, ALK.). A imuno-histoquímica é imprescindível para a adequada classificação dos linfomas – não é mais cabível realizar diagnóstico e classificação dos linfomas sem sua utilização de rotina.

A lista de anticorpos primários é grande e em contínuo crescimento, tendo sido desenvolvido esquema para padronização da nomenclatura: a terminologia CD (“clusters of differentiation”) inclui números atribuídos a vários anticorpos / clones que reagem com os mesmos antígenos ou similares expressos em células hematolinfoides. Os números são atribuídos nos International Leukocyte Workshops com terminologia unificada facilitando a comunicação e a comparação de resultados, indo de CD1 até CD371 (últimas adições no Human Leukocyte Differentiation Antigen workshop – HLDA10, Wollongong, Austrália, 2014), e alguns números podem ter subtipos, como CD1a, CD1b, CD1c.

Atualmente, quase todos os marcadores linfoides são facilmente demonstráveis em secções de parafina, após recuperação antigênica eficaz. É importante que a interpretação da imuno-histoquímica seja utilizada no contexto da morfologia (arquitetural e celular). Deve-se observar se as células de interesse estão adequadamente imunomarcadas – o padrão de coloração deve ser correto para cada anticorpo em questão, por exemplo: a coloração de membrana para a maioria dos marcadores de leucócitos; coloração nuclear para a proteína TdT, PAX5, MUM1 e SO11; marcação citoplasmática para CD79a, BCL2, mieloperoxidase etc. A utilização de controles externos é imprescindível para todos os marcadores, de preferência localizados na mesma lâmina do caso em estudo.

Os marcadores mais importantes a serem utilizados na prática e que costumam funcionar em tecidos fixados e incluídos em parafina estão descritos na tabela 1 e os painéis IHQ básicos para os principais tipos de linfoma não Hodgkin são apresentados na tabela 2.

Tabela 1: Anticorpos primários mais frequentemente utilizados para a classificação dos linfomas e das neoplasias hematopoéticas.

Antígeno Marcação e informações relevantes
ALK1 Linfoma anaplásico de grandes células. As células normais (incluindo células linfoides) são todas negativas para ALK, exceto algumas células raras no sistema nervoso central. É expresso no linfoma anaplásico de grandes células ALK+, raros linfomas de grandes células B, na histiocitose sistêmica ALK+, em parte dos tumores miofibroblásticos inflamatórios, rabdomiossarcomas e em subgrupo de adenocarcinomas pulmonares. A distinção dos linfomas anaplásicos de grandes céluas entre ALK+ ou – é de fundamental importância para tratamento e prognóstico dos pacientes
BCL2 Subgrupo de linfócitos. É útil para distinguir entre linfoma folicular (BCL2+) e hiperplasia folicular reativa (BCL2-); não é útil na classificação dos linfomas de pequenas células B, porque muitos desses linfomas diferentes são BCL2+.
BCL6 Marcador de células centrofoliculares (nuclear), normalmente expresso em células B dos centros germinativos, nas células CD30+ perifoliculares e em subpopulação rara de células T foliculares auxiliares. Entre os linfomas, mostram imunorreatividade para BCL6: linfoma folicular, alguns casos de linfoma de grandes células B, linfoma de Burkitt, alguns casos de linfoma anaplásico de grandes células, linfoma de células T angioimunoblástico, linfoma de células Tfh e as células L&H do linfoma de Hodgkin tipo predomínio linfocitário nodular. Outro soro que identifica origem em centro germinativo é o LMO2.
BRAF V600E Novo marcador para tricoleucemia; pode ser utilizado para diagnóstico e detecção de doença residual mínima
CD1a Célula T tímica imatura, Histiocitose de células de Langerhans, Sarcoma de células de Langerhans.
CD2 Marcador pan-T sensível e específico. Mais caro do que CD3, pode ser utilizado como marcador complementar, quando necessário. A coloração é frequentemente na zona de Golgi e membrana celular.
CD3 Célula T, célula NK. Marcador pan-T mais comumente utilizado na prática diagnóstica de rotina.
CD4 Célula T auxiliar e histiócitos / monócitos
CD5 Célula T madura e um pequeno subgrupo de células B. Positivo no linfoma linfocítico / leucemia linfoide crônica e linfoma de células do manto, a coloração é frequentemente mais fraca em comparação com as células T reativas ao fundo. Cerca de 10% dos linfomas de grandes células B também são CD5+.
CD7 Célula T imatura e madura, célula NK. Marcador pan-T que se expressa no início de desenvolvimento de células T. Particularmente útil para demonstrar a linhagem T no linfoma linfoblástico, se CD3 for negativo.
CD8 Célula T citotóxica
CD10 Célula B-CG, T-CG, CPL e granulócitos. É o antígeno comum da leucemia linfoblástica aguda (CALLA), normalmente expresso por células centrofoliculares e células linfoides imaturas. Algumas células estromais fusiformes e todos os neutrófilos também são CD10+ (servindo como controle positivo interno). É positivo nos seguintes tipos de linfoma: linfoma folicular, linfoma de Burkitt, alguns casos de linfoma de grandes células B, linfoma / leucemia B linfoblástica, linfoma de células T angioimunoblástico e linfoma de células Tfh. Pode marcar outras neoplasias, como hepática e renal.
CD15 Marcador para células mieloides normais e neoplásicas e linfoma de Hodgkin clássico.
CD20 Célula B madura, exceto o plasmócito. Muito sensível (> 95% de linfomas de células B são positivos); embora a coloração em LLC-B seja muitas vezes fraca, é um excelente marcador pan-linfoide B; apresenta o inconveniente de não marcar bem precursores B (leucemia / linfoma linfoblástico B) e linfomas com diferenciação plasmocítica (linfoma linfoplasmocítico, plasmocitoma, vários linfomas de grandes células, variante imunoblástica); não marca neoplasias B após tratamento com o anticorpo monoclonal anti-CD20, pode marcar linfoma de Hodgkin clássico de maneira heterogênea.
CD21 e CD35 Células foliculares dendríticas, subgrupo de células B.  As células foliculares dendríticas são proeminentes nos seguintes tipos de linfoma: linfoma de células do manto (dispersos ou emaranhados nodulares), linfoma de células T angioimunoblástico (redes extrafoliculares perivasculares), linfoma de Hodgkin nodular de predominância linfocitária (tramas nodulares) e linfoma de Hodgkin clássico nodular rico em linfócitos (tramas nodulares). Positivo nos sarcomas de células foliculares dendríticas.
CD23 Células foliculares dendríticas, subgrupo de células B. Expresso na maior parte dos casos de leucemia linfocítica crônica de células B / linfoma linfocítico (a coloração pode ser focal e irregular, e pode limitar-se às células maiores). CD23 também cora células dendríticas foliculares, podendo substituir o CD21. Tipicamente positivo na variante difusa do linfoma folicular.
CD30 Marcador para as células linfoides ativadas; algumas células CD30+ são normalmente encontradas na região perifolicular. Existe aumento das células CD30+ nas hiperplasias linfoides reacionais. A coloração deve estar na membrana celular e na zona de Golgi; a coloração citoplasmática pura deve ser considerada inespecífica. É positivo em: linfoma de Hodgkin clássico (células de Reed-Sternberg e variantes), linfoma anaplásico de grandes células e alguns linfomas de grandes células B e linfomas T periféricos. O CD30 também é positivo no carcinoma embrionário. O teste de expressão de CD30 nas neoplasias tem sido muito requisitado devido ao desenvolvimento de terapia alvo com brentuximab vedotin.
CD34 Positivo em cerca de 40% das leucemias mieloides agudas e 70% das leucemias / linfomas linfoblásticos B; pode estar presente em várias outras neoplasias (vasculares, fusocelulares).
CD43 Células T e mieloides: altamente sensível para a linhagem T, mas não muito específico (muitas neoplasias de células B podem ser CD43+), pois também cora histiócitos e células mieloides, bem como os seus tumores. A expressão em células B pode ser estimulada em infecção por EBV. A melhor utilidade é para o diagnóstico de linfomas de pequenas células B (procurando pela expressão aberrante nessas células).
CD45 (LCA) Positivo em todas as células normais linfoides (linhagens B, T ou NK), exceto os plasmócitos. Útil na distinção de neoplasias indiferenciadas; sua positividade afasta outras neoplasias não hematológicas, como carcinomas, melanoma, sarcomas; pode ser negativo em até metade de alguns tipos de linfoma de grandes células, como o linfoma de grandes células anaplásico. As células de Reed-Sternberg (do linfoma de Hodgkin clássico) são CD45-. Se os achados histológicos de HE são de linfoma não Hodgkin, geralmente não é necessário testar CD45: pode-se seguir diretamente para marcadores de linhagem (por exemplo, CD20, CD3).
CD45RB Pan-leucocitário
CD45RO Marcador sensível, mas pouco específico para a linhagem T: 80 a 90% dos linfomas de células T periféricos são CD45RO+. Alguns linfomas de células T podem ser CD3- CD45RO+. Atentar-se para o fato de os linfomas T linfoblásticos serem frequentemente CD45RO- (enquanto CD43+) e o anticorpo também corar histiócitos e células mieloides, assim como os seus tumores. Casos raros de linfomas de células B (até 5%, predominando nos linfomas de grandes células B) podem ser CD45RO+. De fato, uma subpopulação de células B normais é CD45RO+
CD56 Células NK/T e mieloma múltiplo. Melhor marcador de linfomas de células NK, não é inteiramente específico para os linfomas de NK; alguns linfomas de células T também podem ser positivos, especialmente os que expressam receptores de células T gama/delta. Também é expresso em plasmócitos neoplásicos e células não hematolinfoides e seus tumores, como células neurais e células neuroendócrinas. Assim, o diagnóstico de linfoma de células NK deve ser suportado pela expressão de outros marcadores linfoides.
CD57 Células NK. Não tem muita utilidade: seu valor no diagnóstico de linfoma de Hodgkin nodular de predominância linfócitária é limitado e o CD56 é melhor marcador de células NK.
CD68 Marcador histiocitário – neoplasias histiocíticas  e leucemia monoblástica.
CD76 / DBA44 Marcador de células B, principalmente da tricoleucemia, em que é positivo em mais de 95% dos casos; pode ser positivo em menos de 20% dos demais linfomas B de pequenas células.
CD79a Célula B, plasmócitos. Bom marcador pan-B sensível e bem específico; costuma marcar neoplasias B mais imaturas até com diferenciação plasmocitária; positivo em aproximadamente 50% dos casos de plasmocitoma, pode ser positivo em alguns linfomas / leucemias linfoblásticos T; pode marcar linfoma de Hodgkin clássico.
CD99 Células precursoras. Inicialmente descrito para o sarcoma de Ewing / PNET, o CD99 é expresso em cerca de 70% dos linfomas / leucemias linfoblástica. Eventualmente, outros linfomas podem ser positivos para CD99 (grandes e pequenas células B), além de uma gama de neoplasias não hematológicas (sarcomas, meningiomas, tumor fibroso solitário).
CD117 Célula progenitora, promielócitos, mastócitos.
CD123 Célula plasmocitoide dendrítica e seus tumores.
CD138 É expresso na membrana celular de plasmócitos, plasmablastos e alguns imunoblastos. Assim, pode ajudar no diagnóstico de plasmocitoma. No entanto, CD138 não é específico para a linhagem hematolinfoide. Um fenótipo “apenas CD138+” não é suficiente para definir o diagnóstico de neoplasia de plasmócitos – deve-se procurar uma positividade para outros marcadores linfoides, como CD45, já que carcinomas também podem ser CD138+.
Ciclina D1 Plasmocitoma, linfoma de células do manto : marcador muito útil, positivo em quase todos os linfomas de células do manto. A coloração deve ser nuclear. Os anticorpos eram difíceis de trabalhar no passado: a coloração podia ser fraca e focal, ou mostrava coloração citoplasmática inespecífica sem coloração nuclear específica. A situação mudou e melhorou muito com a chegada dos anticorpos monoclonais de coelho (SP4), cuja coloração nuclear é facilmente detectada. A amígdala normal é um tecido excelente para controle externo – células endoteliais, histiócitos e células suprabasais no epitélio escamoso estratificado exibem positividade multifocal fraca a moderada e células linfoides normais são totalmente negativas. Pode ser positivo (focal e fraco) em mielomas (25%), LLC/LL-B, tricoleucemias e neoplasias não hematológicas.
CXCL13 Célula Tfh, linfomas angioimunoblásticos e linfomas nodais Tfh.
DBA44 Células cabeludas, subgrupos de células B
IgA, IgD, IgM, IgG, IgG4 Imunoglobulinas. A relação IgG / IgG4 é útil para o diagnóstico da Doença esclerosante relacionada à IgG4
Kappa e Lambda Cadeias leves da imunoglobulina. A detecção do componente citoplasmático é mais fácil; a restrição de uma dessas cadeias favorece o diagnóstico de neoplasia (as hiperplasias mostram padrão policlonal, ou seja, expressão balanceada de ambas as cadeias leves) e ainda a sua origem linfoide B (já que neoplasias com diferenciação plasmocitária costumam ser CD20-). Não é incomum ver coloração forte do fundo por causa da presença de Ig nos fluidos do soro que banham os tecidos. A Ig sérica também pode ser absorvida, de maneira inespecífica, pelas células. Assim, a coloração é considerada verdadeira somente nessas situações: apenas coloração da membrana celular, coloração com acentuação em torno da membrana nuclear, coloração predominantemente na zona de Golgi.
Ki-67 Marcador de proliferação celular: marca todas as células que entraram no ciclo celular e pode ajudar na distinção entre linfoma folicular e hiperplasia folicular reativa (um índice baixo, se encontrado, favorece fortemente o linfoma folicular). Pode auxiliar no diagnóstico de linfoma de Burkitt (aproximadamente 100% de células positivas). Um índice alto de Ki-67 está relacionado com pior prognóstico em linfoma de células do manto e possivelmente nos linfomas foliculares nodais graus 1 e 2.
LEF1 Marcador pan-T (mesma sensibilidade e especificidade do CD3), mostra expressão aberrante na maioria dos casos de linfoma linfocítico de pequenas células B/LLC e em casos de síndrome de Richter.
Lisozima Monócitos / histiócitos, granulócitos
Mieloperoxidase Linhagem granulocítica – leucemia mieloide aguda (diferencial com linfomas e leucemias linfoides).
MUM-1 Células B pós-centro germinativo, plasmócitos e células de Reed-Sternberg do linfoma de Hodgkin clássico. Positivo nos linfomas de grandes células com rearranjo do IRF4, plasmocitomas, mielomas múltiplos, linfomas plasmablásticos, linfomas difusos de grandes células B não centro germinativo.
MYC A expressão imuno-histoquímica do MYC não indica a presença da translocação do mesmo. Estudos recentes demonstraram que linfomas com altos níveis de expressão de MYC (40% das células ou mais) na IHQ tem mais chance de ter a translocação. A IHQ para MYC é recomendada como teste de triagem para o FISH de MYC. Casos de LDGCB positivos para MYC e BCL2 demonstram pior prognóstico independente da translocação do MYC.
Oct-2 e Bob.1 Marcadores de células B, são fatores de transativação, normalmente expressos nos núcleos de células B, incluindo os plasmócitos. Em geral, a expressão de Bob.1 nos plasmócitos é mais forte do que Oct-2. Principal aplicação destes anticorpos: linfoma de Hodgkin versus linfoma de grandes células B rico em células T. As células de Reed-Sternberg no linfoma de Hodgkin quase sempre são negativas para Oct-2 e Bob.1, embora raramente um dos dois possa ser expresso. Linfomas de células B quase sempre expressam ambos: se estes forem negativos, o linfoma de Hodgkin clássico é favorecido; se ambos forem positivos, o linfoma de células B é favorecido. Se apenas um deles for positivo, os achados são inconclusivos. O diagnóstico em situações de suspeita de plasmocitoma ocorre quando todos os outros marcadores (como CD138, CD79a) forem negativos. Alguns linfomas de células T podem ser positivos para Oct-2 ou Bob.1, especialmente Bob.1.
PAX5 Linfócitos B maduros e CPL-B, CH (fraco). Fator de transcrição específico de células B (marcação nuclear), também conhecido como BSAP (proteína ativadora específica de células B). Nas células normais, é expresso desde os estágios iniciais de desenvolvimento da célula B até a célula B madura, exceto os plasmócitos, e é quase o equivalente em cortes de parafina do CD19 em termos de expressão nas células B. Praticamente todas as neoplasias de células B, com exceção de plasmocitoma / mieloma, são positivas para PAX5. Linfomas de células T são negativos. As células de Reed-Sternberg do linfoma de Hodgkin clássico geralmente apresentam coloração fraca para PAX5, auxiliando no diagnóstico diferencial com linfoma anaplásico de grandes células (PAX5-). As aplicações mais importantes são: para determinar a linhagem B de neoplasias linfoblásticas (que muitas vezes são CD20- e CD43+); linfoma de Hodgkin clássico versus linfoma anaplásico de grandes células (as células de Reed-Sternberg mostram coloração fraca para PAX5, enquanto o último é negativo); para confirmar a linhagem B de linfoma de células B, mas que é CD20-.
PD1 Marcador de células T auxiliares; útil para [1] diagnóstico dos linfomas originários de células T auxiliares, como os linfomas angioimunoblásticos e os linfomas nodais Tfh; [2] diagnóstico diferencial entre linfoma da zona marginal nodal (+++ nos centros germinativos) e linfoma folicular tipo pediátrico (+/- nos centros germinativos); [3] diagnóstico diferencial entre linfoma de Hodgkin tipo predomínio linfocitário nodular e linfoma de grandes células B difuso rico em células T e histiócitos. Devemos comparar a intensidade de coloração do PD1 da lesão com os linfócitos Tfh dos folículos reacionais. A intensidade deve ser forte em ambos para considerarmos positivo.
SOX11 Linfoma de células do manto; mais sensível que a Ciclina D1, com expressão nuclear, sendo positivo inclusive em casos de ciclina D1 negativa.
TCRab e TCRgd Células T. Anticorpos contra alfa/beta-TCR (como beta-F1) ou gama/delta-TCR estão disponíveis. Embora o beta-F1 possa ser utilizado em bloco de parafina, com clones atuais mais confiáveis. O anticorpo para gama/delta-TCR é necessário para o diagnóstico de linfomas de células T gama/delta.
TdT TdT (deoxinucleotidil-transferase terminal): positivo nos linfomas / leucemias linfoblásticas B e T, em padrão nuclear; necessita de tecidos bem fixados e recuperação antigênica potente para sua utilização; até 15% das leucemias mieloides agudas podem ser positivas. Praticamente não existem células TdT+ fisiológicas, excluindo-se o timo, amígdala (presentes em pequeno número, especialmente na base), medula óssea (hematogônias isoladas) e linfonodos em crianças (presentes em pequeno número). Alguns casos de neoplasia blástica de células plasmocitoides dendríticas também são positivos.
TIA-1, perforina e granzima Célula T citotóxica. A coloração é granular e citoplasmática e coram células normais NK e um subgrupo de linfócitos T. Linfomas NK e muitos linfomas de células T extranodais são positivos para marcadores citotóxicos.
VS38c Plasmócito

CG: centro germinativo; CL: células de Langerhans; NK: natural killers; CH: célula de Hodgkin; CFD: célula folicular dendrítica; CPL: célula precursora linfoide; lg: imunoglobulina.

Tabela 2 Painéis IHQ básicos para a classificação dos principais tipos de linfomas não Hodgkin.

  CD3 CD5 CD10 CD20 CD23 BCL2 CD30 CICLINA / SOX11 TdT
LDGCB – -/+ +/- + -/+ +/- -/+ – –
LF – – + + – + – – –
LLC/LL – + – + + + – – –
LCM – + – + – + – + –
MALT / LZMN – – – + – + – – –
LB – – + + – – – – –
LLA-B – – + +/- – +/- – – +
LLA-T +/- +/- + – – +/- – – +
LTP + + – – – + -/+ – –
LTAI + + + – + + – – –
LGCA -/+ – – – – +/- + – –

LDGCB= linfoma difuso de grandes células B, LF= linfoma folicular, LLC/LL= leucemia linfoide crônica / linfoma linfocítico, LCM= linfoma de células do manto, MALT/LZMN= linfoma de células da zona marginal extranodal / nodal, LB= linfoma de Burkitt, LLA-B= leucemia / linfoma linfoblástico B, LLA-T= leucemia / linfoma linfoblástico T, LTP= linfoma de células T periférico, SOE, LTAI= linfoma de células T angioimunoblástico, LGCA= linfoma de grandes células anaplásico (ALK+/-).

7.3.2 Hibridização “in situ” fluorescente (FISH) e cromogênica (CISH)

A hibridização “in situ” fluorescente (FISH) foi descrita em 1989 por van Dekken H. e colaboradores para avaliação do sucesso de transplantes de medula óssea. Desde então vem sendo utilizada no diagnóstico de síndromes genéticas, diagnóstico pré-natal, transplantes e diagnóstico e prognóstico de neoplasias variadas.

As técnicas de hibridização “in situ” são excelentes escolhas para detecção de translocações, amplificações e deleções de genes. A lógica da técnica é: utilização de uma sonda de DNA com a sequência conhecida desejada marcada, colocada sobre um corte de tecido convencional que foi submetido a tratamento de alta temperatura e/ou enzimático para abrir a dupla fita de DNA – caso o tecido a ser examinado possua o gene pesquisado irá ocorrer ligação deste com a sonda (DNA complementar). A visualização da reação depende da técnica utilizada: as sondas podem ser marcadas com fluorocromos de diversas cores (FISH), método imuno-histoquímico cromogênico (CISH) ou método imuno-histoquímico associado à prata (SISH), logo, as lâminas resultantes serão observadas em microscópio de fluorescência (FISH) ou microscópio convencional (CISH e SISH).

O FISH é a técnica-ouro dentre as diferentes metodologias de hibridização “in situ”. A vantagem do FISH sobre outras hibridizações “in situ” é principalmente devido à excelente resolução e facilidade de análise, porém seu custo é significativamente maior. O CISH / SISH são utilizados principalmente para avaliações de amplificação gênica e pesquisa de vírus, devido a limitações de resolução.

Existem 3 tipos de sondas de FISH disponíveis, que devem ser escolhidas de acordo com a mutação a ser estudada:

  • Quebra (“Break-apart”): um único gene tem suas porções proximal e distal marcadas com fluorocromos de cores diferentes. Quando não há translocação envolvendo o gene, ambas marcações, (frequentemente são utilizados fluorocromos verde/FITC e vermelho/TRICT, estão próximas (podendo gerar um sinal amarelo entre elas). Quando há translocação envolvendo o gene, as marcações verde e vermelha estão distantes. É o tipo mais usado em Patologia dos linfomas. Ex.: MYC, BCL2, BCL6, ALK, IGH, IRF4.
  • Fusão: Dois genes distintos são marcados com cores diferentes (verde e vermelho). Quando há fusão envolvendo ambos genes, ambas marcações, verde e vermelha, estão próximas (podendo gerar um sinal amarelo entre elas). Quando não há fusão envolvendo os genes, as marcações verde e vermelha estão distantes. Ex.: BCR/ABL, ALK/EML4.
  • Avaliação numérica: o número de cópias de um gene é quantificado pelo número de sinais fluorescentes, permitindo diagnosticar amplificações ou deleções; geralmente associado com a marcação de um centrômero do cromossomo onde o gene é localizado (com cor diferente do gene), para permitir identificar aneussomias e alterações na relação gene / centrômero, para evitar erro diagnóstico. Ex.: TP53, HER2, 1p, 19q, MDM2, NMYC.

O FISH é bastante utilizado no diagnóstico dos linfomas, particularmente para confirmar os diagnósticos de linfoma de grandes células tipo “double-hit” ou “triple-hit” onde é importante avaliar se há translocações envolvendo os genes MYC, BCL2 e BCL6. Outros exemplos incluem pesquisa de translocação envolvendo o gene IRF4/MUM1 no linfoma de grandes células B com rearranjo IRF4, de translocação envolvendo o gene ALK no linfoma de grandes células anaplásico e de deleção do gene TP53, prognóstica no linfoma linfocítico / leucemia linfoide crônica e no mieloma múltiplo, entre outros.

As principais utilizações da hibridização “in situ” cromogênica (CISH) em Hematopatologia são:

  • Detecção de vírus, particularmente o EBV (sonda EBER): usualmente sondas de oligonucleotídios que reconhecem o RNA do EBV, marcadas com digoxigenina e/ou biotina. As sondas marcadas são detectadas usando anticorpos primários, que são detectados por anticorpos secundários conjugados com enzimas que reagem com substratos cromogênicos (DAB, NBT/BCIP ou AEC), levando à formação de precipitados de cor que podem ser visualizados por microscopia convencional. Praticamente todos os linfomas T/NK nasais são positivos para EBER (útil na confirmação diagnóstica); cerca de 70% dos linfomas de Burkitt no Brasil são EBER+, enquanto raramente os linfomas de grandes células B o são (com exceção dos linfomas associados a estados de imunodeficiências, que são frequentemente EBER+); cerca de metade dos linfomas de Hodgkin clássicos é EBER+, enquanto os linfomas não Hodgkin de grandes células anaplásico são EBER-. O estudo de EBER é indicado atualmente em todos os linfomas de grandes células B e nas desordens linfoproliferativas relacionadas a imunossupressão (pós-transplante, pós-QT, iatrogênicas, congênitas ou constitucionais e outros).
  • Determinação de clonalidade de células B: podem ser utilizadas sondas de oligonucleotídios Ig-kappa e Ig-lambda marcadas com digoxigenina e/ou biotina. As sondas marcadas são detectadas usando anticorpos primários, que são detectados por anticorpos secundários conjugados com enzimas que reagem com substratos cromogênicos (DAB, NBT/BCIP ou AEC), levando à formação de precipitados de cor que podem ser visualizados por microscopia convencional. Existem kits que permitem utilizar ambas sondas simultaneamente na mesma lâmina para determinar a clonalidade mais facilmente.

7.3.3 Reação em cadeia da polimerase (PCR)

A reação em cadeia da polimerase foi desenvolvida em 1983 pelo Dr. Kary B. Mullis que, em 1993, foi honrado com o prêmio Nobel de química por sua descoberta. Os primeiros testes foram com doenças herdadas geneticamente e ensaios de clonalidade em neoplasias hematológicas e, posteriormente evoluiu para diagnósticos moleculares em quase todas as áreas e se tornou um padrão molecular da Patologia por permitir avaliação de amostras fixadas em formol e incluídas em parafina.

Na PCR, o DNA ou RNA celular é extraído e clivado com enzimas para permitir que a sequência de ácidos nucléicos de interesse seja identificada através de sondas (“primers”) e seletivamente amplificada, resultando em produção abundante de “amplicons” específicos (fragmentos de amplificação resultantes). Uma PCR média de 30 ciclos resultará em uma amplificação de aproximadamente 1 bilhão de vezes da sequência alvo. Existem várias formas de visualizar os produtos da PCR, podendo ser qualitativas (usualmente baseadas em técnicas de eletroforese) ou quantitativas ou “PCR em tempo real” (onde instrumentos automatizados têm a capacidade de analisar os produtos da PCR em tempo real com resultados quantitativos).

A PCR já foi bastante utilizada para pesquisa de clonalidade linfocitária, detecção de doença residual mínima em linfomas e de mutações específicas em casos de adenocarcinomas de pulmão e colo-retal e melanoma (ex. BRAF V600E, KRAS, EGFR), porém vem perdendo espaço para as técnicas de sequenciamento gênico, que, além de pesquisar múltiplas mutações simultaneamente, estão ficando cada vez mais rápidas e com custo em queda.

7.3.4 Sequenciamento gênico, perfil de expressão gênica (GEP) e outras técnicas genéticas

Os primeiros métodos de sequenciamento foram desenvolvidos na década de 1980, porém, eram extremamente custosos, manuais e muito lentos. A automação só ocorreu há cerca de 2 décadas (em 2004 o Projeto Genoma Humano publicou uma versão parcial do sequenciamento) e, até o presente, ainda há partes do genoma humano não sequenciado (cerca de 5% de DNA satélite). Desde então novas técnicas de sequenciamento têm surgido, denominadas de sequenciamento de alta produtividade (ou “next generation” / “próxima geração” – NGS), como o Illumina, pirossequenciamento, sequenciamento de SMRT e nanopore, e o custo de um sequenciamento “completo” caiu de mais de US$25.000,00 para menos de US$1.000,00.

O sequenciamento de nova geração (NGS) está revolucionando a Medicina, particularmente a Patologia e a Oncologia, mas ainda tem grandes desafios de tempo, custo, informática e de pessoal qualificado para construir, manter e disseminar uma infra-estrutura prática, robusta, escalável, segura e economicamente viável, onde certamente a inteligência artificial e o Patologista terão papel importante.

Assim, todo o gigantesco esforço para a avaliação do genoma humano criou a possibilidade de procurar as alterações genômicas responsáveis pelo desenvolvimento e progressão do câncer. Essas alterações globais do genoma e do transcriptoma das neoplasias têm sido estudadas por diferentes tipos de sequenciamento de próxima geração ou, uma forma mais resumida e direcionada – as plataformas de microarranjos de DNA (“DNA microarray”, chip de DNA, biochip).

Um microarranjo de DNA é uma coleção de pequenos fragmentos de DNA (sondas) ligados a uma superfície sólida (“chip”), arranjados em uma matriz com conteúdo e localização conhecidos para cada sonda. Podem ser utilizados para medir os níveis de expressão de muitos genes simultaneamente ou para genotipar múltiplas regiões de um genoma. Os microarranjos de DNA podem ser usados para detectar DNA (como na hibridização genômica comparativa), ou RNA (mais comumente como cDNA após transcrição reversa). A lógica do teste é: ao ser adicionada uma amostra do DNA a ser estudado (alvo), ocorre a ligação com as sondas adequadas (hibridização sonda-alvo) presentes e ordenadas na plataforma (“chip”); após lavagem o DNA-alvo que não se ligou a nenhuma sonda é eliminado e as ligações sonda-alvo que ocorreram podem ser detectadas e quantificadas (chamado de análise de expressão gênica Asou perfil de expressão gênico). O chip pode ser construído com sondas de interesse para determinado cenário, como, por exemplo, chip com mutações já encontradas nos linfomas, o que restringe a abrangência (quando comparado ao sequenciamento completo do genoma), mas reduz muito o tempo de execução, a análise bioinformática e o custo.

As técnicas de Patologia molecular estão mudando radicalmente nosso conhecimento sobre os linfomas – grande parte das alterações da nova classificação da OMS 2017 são provenientes de estudos moleculares que identificaram “assinaturas genéticas” relacionadas à oncogênese de diversos linfomas. Assim, foi possível, em menos de uma década depois da edição anterior, identificar novas entidades, categorias e subtipos moleculares, além de desenvolver novos anticorpos para IHQ e a detectar vias oncogênicas com potencial para terapias-alvo. Como limitações ainda temos que melhorar a qualidade das amostras, que sofrem com os processos convencionais de fixação e processamento, desenvolver e aperfeiçoar pessoas e equipamentos das áreas médica e de bioinformática e reduzir custo para permitir maior utilização na prática médica de rotina.

7.4 Roteiro para o processamento do linfonodo

Preferencialmente, o linfonodo (LN) deve ser retirado por inteiro e enviado imediatamente a fresco para o patologista, evitando-se pinçamento. Embora o tamanho não esteja correlacionado com o envolvimento por neoplasia, se houver LN de vários tamanhos, possíveis de serem retirados, o maior deve ser amostrado. Ao transportar o LN para o laboratório de patologia, deve-se ter o cuidado de evitar o ressecamento (como ocorre se ele for colocado em gaze seca; utilizar gaze úmida). Se o LN for pequeno (< 1 cm), pode ser cortado no maior eixo. Se for maior, secções transversais de 2 a 3 mm de espessura podem ser feitas para o estudo histológico, entre outros. Essas secções devem ser feitas com lâmina afiada e estéril, para evitar contaminações para os estudos microbiológicos e de biologia molecular.

Quando recebidos a fresco, preparados citológicos devem ser feitos e secados ao ar. Estes podem ser corados com coloração de Giemsa ou Leishman e fornecem detalhes especiais para o diagnóstico de leucemias não linfoides, linfoma linfoblástico e linfoma de Burkitt. Além do mais, prestam-se a estudos citoquímicos, como esterase ácida, esterase inespecífica, cloroacetatoesterase, peroxidase, coloração Sudan negro e outros. Esfregaços citológicos fixados em álcool podem ser corados pelo HE e podem demonstrar detalhes morfológicos para neoplasias não hematológicas.

Quando houver suspeita de processo infeccioso fragmentos estéreis devem ser enviados em meios de cultura adequados para estudos microbiológicos.

Amostras para imunofenotipagem por citometria de fluxo e estudo citogenético devem ser encaminhadas estéreis e em meio de transporte adequado, como RPMI

O fixador universal, a formalina a 10% tamponada, de boa qualidade, por no máximo 24 horas, permite a realização adequada da coloração HE, colorações especiais, imuno-histoquímica e técnicas genéticas, como PCR e FISH. Cuidado ao utilizar outros fixadores – Bouin, B5 e outros fixadores com zinco ou ácidos causam destruição do DNA, impossibilitando análises genéticas. Para alguns estudos, como extração de DNA e RNA, pode ser necessário o rápido armazenamento do material e seu em OCT a –80°C ou em nitrogênio líquido.

É importante ressaltar que cada laboratório deve ter um protocolo por escrito de processamento desses espécimes, que possa ser seguido de forma padronizada. Além disso, a identificação precisa de todos os fragmentos é essencial.

VIII. Considerações gerais

8.1 Estadiamento dos linfomas

Apesar de se considerar que a classificação dos estádios dos linfomas é um atributo do clínico que certamente terá todas as informações necessárias para fazê-la – as quais, na maioria dos casos, faltam ao patologista –, esta é realizada de acordo com o sistema American Joint Committee AJCC/UICC:

-Estádio I: envolvimento de um linfonodo ou um grupo regional (I) ou de apenas um sítio extranodal sem envolvimento nodal (IE).

-Estádio II: envolvimento de dois ou mais linfonodos ou grupos regionais do mesmo lado do diafragma (II) ou de um sítio extranodal e seu correspondente grupo de linfonodo de drenagem (IIE). O número de linfonodos envolvidos pode ser indicado na forma subscrita (exemplo, II3).

-Estádio III: envolvimento de linfonodos dos dois lados do diafragma (III) que pode estar associado ao envolvimento de um órgão extranodal adjacente a um linfonodo (IIIE) ou do baço (IIIS) ou de ambos (IIIE+S).

-Estádio IV: doença disseminada, multifocal, envolvendo um ou mais órgãos extranodais com ou sem associação com envolvimento nodal (p. ex., fígado, medula óssea).

-Além da ideia de extensão da doença, deve-se associar a informação da presença de sintomas: A= sem sintomas; B= com sintomas (febre inexplicável acima de 38°C; sudorese noturna profusa, que necessita de troca das roupas de cama; perda inexplicável de mais de 10% do peso nos 6 meses precedentes ao diagnóstico. Nota: prurido isolado, intolerância ao álcool, fadiga ou períodos isolados e curtos de febre associados com episódios infecciosos não correspondem a “sintomas B”.

 8.2 Fatores prognósticos e preditivos

Existem vários sistemas para prever o prognóstico e orientar tratamento. O primeiro desses sistemas foi o Índice de Prognóstico International (IPI), que foi originalmente desenvolvido para linfomas agressivos de células B e de células T, mas é preditivo em essencialmente todos os subtipos de linfoma não-Hodgkin. Outros sistemas existem, particularmente para linfoma folicular, linfoma de células do manto e linfoma células T periférico.

Os fatores de mau prognóstico, segundo o IPI, são:

  • Idade igual ou superior a 60 anos;
  • Estádio III ou IV;
  • Número de sítios extranodais acometidos maior que 1;
  • Mau estado clínico do paciente (status performance maior ou igual a 2);
  • LDH (desidrogenase lática) sérica elevada.

Se a cada um desses critérios for atribuído um ponto, será obtida uma escala de prognóstico: baixo (0 ou 1 ponto), baixo intermediário (2), alto intermediário (3) e alto (4 ou 5).

Além dos sistemas como o IPI e correlatos e do próprio diagnóstico adequado da entidade, são também fatores prognósticos e preditivos importantes:

-Classificação molecular por IHQ dos linfomas difusos de grandes células B: Os linfomas difusos de grandes células B, SOE são heterogêneos em relação à morfologia (podem ser compostos por centroblastos, imunoblastos, mistos ou anaplásicos), apresentação clínica (nodal ou extranodal, pacientes pós-transplante, sítios primários “especiais”, como cabeça e pescoço e pele), biologia (pacientes previamente hígidos ou imunodeficientes, associação com vírus) e resposta ao tratamento. A descoberta de uma “assinatura genética” da célula de origem dos LDGCB através de estudos de expressão gênica (gene expression profiling – GEP) permitiu reagrupar esses linfomas de forma independente da morfologia e relevante para seu tratamento, trazendo maior uniformidade de resposta. Como já referido anteriormente, há diversas propostas para tentar substituir a classificação molecular da GEP pela imuno-histoquímica, uma vez que esta é mais acessível e disponível. Os principais algoritmos IHQ propostos são os de Hans, Choi e Visco-Young. Apesar de não serem intercambiáveis e sem relação perfeita com a expressão gênica, estudos recentes mostram haver ganho na utilização preditiva desses algoritmos IHQ. O algoritmo mais utilizado é o de Hans e cols., que utiliza os anticorpos anti CD10, BCL6 e MUM1 para estratificar os casos em “tipo células do centro germinativo” (CG: CD10+, BCL6+/- e MUM1-) e “tipo células B ativadas” (ABC: CD10-, BCL6 -/+, MUM1+).

– Alguns marcadores imuno-histoquímicos isolados também podem ser de valor prognóstico, como a imunoexpressão de ALK1 no linfoma anaplásico de grandes células está associada à melhor sobrevida significativa. Outros fatores importantes são a marcação para o Ki-67 nos linfomas de células do manto e linfomas foliculares graus 1 e 2 histológicos (Ki-67 > 30% indicativo de pior prognóstico) e proteínas relacionadas à apoptose, como o BCL-2 em LDGCB (pior prognóstico).

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